Ateneo - UPO

Ad una prima parte del corso che illustra l'applicazione delle metodologie biochimiche in diversi campi della ricerca medico-sanitaria, segue una rapida ricapitolazione delle proprietà chimico fisiche e funzionali delle macromolecole biologiche, caratteristiche che possono essere sfruttate per l'isolamento, la produzione, l'analisi e la manipolazione di queste ultime. In particolare, il corso è strutturato in una prima sezione che descrive le tecniche e i sistemi che possono essere impiegati per la produzione di proteine ricombinanti (o adattati ad esigenze specifiche), ad includere l'uso/consultazione di banche dati pubblicamente accessibili per l'analisi ed il confronto di sequenze nucleotidiche ed amminoacidiche. In seguito vengono illustrate le principali tecniche ad oggi disponibili per la purificazione e l'analisi biochimica e funzionale di proteine e complessi macromolecolari, ottenuti a partire dalle fonti naturali o espresse in forma ricombinante.

Stoppini, M e Bellotti, V “Biochimica Applicata” Ed. EdiSES
ISBN 9788879597135
- Bonaccorsi di Patti, MC, et al. “Metodologie Biochimiche” Ed. CEA
ISBN 978-8808-18329-3
- Monografie suggerite di volta in volta dal Docente
Il materiale non coperto da diritti d'autore e prodotto dal Docente (utilizzato a supporto delle lezioni frontali in aula) verrà messo a disposizione dello Studente al termine delle lezioni di ogni "pacchetto" di argomenti (analisi e purificazione di acidi nucleici; analisi e purificazione di proteine; studio delle interazioni fra macromolecole) e rappresenterà lo spunto per ulteriori approfondimenti ed integrazioni.
Tutto il materiale ed esempi di prove di compito saranno accessibili dalla piattaforma "DIR".

Il corso di “Biochimica Applicata” descrive gli aspetti teorici e pratici e l’impatto dell’applicazione dello studio delle macromolecole biologiche in diversi settori di Ricerca, dalle scienze mediche e della vita, alle discipline bio-analitiche. Il corso si propone di fornire un solido background a studi ed attività di ricerca futuri dello Studente, finalizzati alla descrizione della struttura e della funzione delle proteine e all'applicazione dell'informazione ottenuta. A tal fine verranno illustrati metodi classici e di punta per la produzione, purificazione, manipolazione e caratterizzazione biochimica di macromolecole destinate all'impiego in campo biomedico e biotecnologico. Mediante l’assegnazione di progetti di ricerca virtuali a gruppi, il Corso vuole stimolare negli Studenti la capacità di ragionare in maniera indipendente e critica, e di lavorare in team.

Si richiede una conoscenza di base:
1) della biochimica delle proteine e degli acidi nucleici
2) dei processi alla base della replicazione del DNA, della trascrizione e della sintesi proteica, con particolare enfasi sui sistemi batterici.

Lezioni frontali.
Preparazione, a gruppi, di un progetto di ricerca virtuale.
6-8 ore di lezione saranno dedicate alla presentazione dei progetti virtuali di gruppo e alla loro discussione peer-to-peer.

Durante le lezioni potrà essere utilizzato materiale audio/video in inglese. Verranno programmate esercitazioni sull'utilizzo di banche dati (in aula informatica).

Esame scritto.
Nel primo esercizio si verificherà la conoscenza dei passaggi necessari per creare una molecola di DNA ricombinante, per l'analisi biochimica/molecolare della stessa o della proteina codificata (max. 8 pt). Il secondo esercizio consisterà nel definire una strategia per l'espressione in un sistema eterologo ad alte rese e la caratterizzazione biochimica e funzionale di una proteina ricombinante (max. 10 pt). La domanda aperta potrà vertere su un argomento tecnico (e.g. Principi ed applicazioni della cromatografia per affinità) o su un argomento di più ampio respiro (e.g. metodi biofisici d'indagine di interazioni macro-molecolari) (max. 12 pt). Il test dovrà essere svolto in ogni sua parte, ottenendo almeno i seguenti punteggi: 1° esercizio 5/8; 2° esercizio: 5/10; domanda aperta:6/12. Lo svolgimento e la presentazione a gruppi del progetto virtuale darà diritto ad un max. di 3 punti supplementari.

Richiami sulle caratteristiche e sui processi di sintesi e modificazione delle macromolecole biologiche, sfruttabili per la loro purificazione/analisi. La tecnologia del DNA ricombinante applicata all'espressione di proteine ricombinanti. La reazione a catena della polimerasi: principi, strumentazione e disegno dei primers. Elettroforesi su gel d'agarosio per l'analisi di campioni di DNA: principi, strumentazione ed esempi. I vettori plasmidici di sottoclonaggio: caratteristiche generali. I vettori plasmidici per l'espressione di proteine ricombinanti in batteri. Altri vettori per la creazione di molecole di DNA ricombinante. La trasformazione di batteri. La purificazione di DNA genomico. La produzione di genoteche di cDNA. Le endonucleasi di restrizione: caratteristiche generali, ruolo fisiologico ed utilizzo nella tecnologia del DNA ricombinante. La reazione di ligazione. Estrazione di frammenti di DNA da matrici d'agarosio. Purificazione di DNA plasmidico da colture batteriche monoclonali. Enzimi utilizzati per la modificazione delle estremità di molecole di DNA a doppio filamento. La mutagenesi sito-specifica basata sull'utilizzo della PCR: principi ed esempi. Il sequenziamento del DNA: il metodo classico di Sanger e sua automazione. Analisi di acidi nucleici mediante tecniche di ibridazione: principi ed applicazioni. Tecniche di marcatura di sonde di DNA. L'espressione di proteine ricombinanti in sistemi eterologhi: trascrizione e traduzione accoppiate in vitro. L'espressione inducibile di proteine in E. coli. Il sistema d'espressione Baculovirus/cellule d'insetto. Il sistema Tet-ON e/o Tet-OFF per l'espressione inducibile di proteine ricombinanti in cellule di mammifero. Il lievito Pichia pastoris come sistema d'espressione di proteine ricombinanti. Lavorare con le proteine: regole generali. Metodi di distruzione cellulare (lisi): shock osmotico, stress meccanico, utilizzo di detergenti per la solubilizzazione di campioni biologici; principi, limiti ed applicabilità dei metodi. La distruzione cellulare mediante ultra-sonicazione: principi ed applicazioni; utilizzo di apparati basati su shock di pressione/impatto.
Centrifugazione di campioni biologici: principi e strumentazione. Frazionamento cellulare mediante centrifugazione differenziale. Quantificazione delle proteine presenti in un campione. Elettroforesi di proteine: principi e strumentazione. La separazione elettroforetica di proteine mediante SDS-PAGE. L'analisi di proteine mediante IEF (focalizzazione isoelettrica; isoelectric focusing): principi, applicazioni e strumentazione. Elettroforesi 2D: principi e strumentazione. Metodi di colorazione "totali" o "gruppo-specifici" di proteine separate mediante elettroforesi. Metodi di immuno-riconoscimento su membrana: il western blot e dot-blot. Saggi immunologici: principi generali. Test ELISA, RIA e saggio immunologico competitivo. L'immuno-cromatografia a flusso laterale applicata a dispositivi usa-e-getta. Introduzione alle tecniche di cromatografia liquida (LC) utilizzate nella purificazione di macromolecole biologiche. La cromatografia per affinità: matrici funzionalizzate con ligandi gruppo-specifici e mono-specifici. Approcci cromatografici per l'isolamento di proteine ricombinanti dotate di "etichette"(tag) di purificazione. La cromatografia a scambio ionico (IEC). La cromatografia per interazione idrofobica (HIC). La cromatografia per "gel filtrazione" (Size Exclusion Chromatography, SEC); altre applicazioni della SEC: studio di interazioni proteina-proteina e dello stato oligomerico di proteine. Metodi per la concentrazione di proteine in un campione. Analisi della composizione in amminoacidi e della struttura primaria delle proteine. Determinazione dei residui N- e C-terminale. Degradazione di Edman. Considerazioni sulle strategie da adottare per l'allestimento di saggi enzimatici per la caratterizzazione di proteine ed il monitoraggio dei passaggi durante una procedura di purificazione di proteine.
Lo studio biochimico delle interazioni macromolecolari. Il sistema doppio-ibrido di lievito "classico" (2HYS) per la conferma d'interazioni fra proteine e come approccio di "interaction cloning". Altri sistemi artificiali "N-ibridi" per lo studio di interazioni fra macromolecole, a livello di specifiche localizzazioni all'interno della cellula. Il fenomeno della "risonanza dei plasmoni di superficie" (surface plasmon resonance, SPR) applicata allo studio quantitativo ed in tempo reale di interazioni fra macromolecole o proteina/ligando a piccola molecola: principi e strumentazione.. Lo studio di proteine in vitro ed in vivo basato sul fenomeno della FRET: principi ed applicazioni.

Lo studente, alla fine del corso, avrà acquisito conoscenza e comprensione degli argomenti trattati e sviluppato la capacità di applicare tali conoscenze in modo autonomo nell'affrontare e risolvere questioni nuove e/o complesse. Più nel dettaglio lo Studente conoscerà e sarà in grado di comprendere: a) metodi, tecniche e protocolli sperimentali per la produzione e la purificazione di proteine ed acidi nucleici destinati all'impiego in campo biotecnologico e diagnostico e b) metodi, tecniche e protocolli sperimentali per la manipolazione e la caratterizzazione biochimica e funzionale di proteine, acidi nucleici e loro complessi. Lo Studente sarà in grado di applicare tali conoscenze e capacità di comprensione per: a) imbastire un protocollo sperimentale per l'espressione e/o la purificazione di proteine, acidi nucleici e loro complessi; b) adattare a casi specifici procedure già presenti in letteratura per l'analisi biochimica e funzionale di macromolecole biologiche; c) sviluppare nuove procedure di analisi biochimica e funzionale di macromolecole biologiche, scegliendo correttamente le condizioni sperimentali e la strumentazione/metodologia adeguate per la conduzione degli esperimenti; d) redigere report su attività sperimentali. Lo Studente saprà attingere alle fonti corrette e selezionare criticamente il materiale di studio nella progettazione della propria attività di ulteriore approfondimento ed espansione delle conoscenze acquisite, conoscenze che lo Studente sarà in grado di comunicare correttamente, usando la terminologia appropriata. Sarà capace di comprendere testi scientifici sugli argomenti trattati, redatti in lingua inglese. Queste capacità potranno, inoltre, rivelarsi utili nell'attività di ricerca sperimentale e nella stesura del manoscritto di tesi, qualora lo Studente decida di svolgere l'internato di tesi in un laboratorio di area "BIO".