Ateneo - UPO

Ad una prima parte del corso che illustra l'applicazione delle metodologie biochimiche in diversi campi della ricerca di base e medico-sanitaria, segue una rapida ricapitolazione delle proprietà chimico fisiche e funzionali delle macromolecole biologiche, caratteristiche che possono essere sfruttate per l'isolamento, la produzione, l'analisi e la manipolazione di queste ultime. La seconda sezione del corso descrive tecniche e sistemi impiegati per la produzione di proteine ricombinanti (o adattati ad esigenze specifiche), ad includere l'uso/la consultazione di banche dati pubblicamente accessibili per l'analisi ed il confronto di sequenze nucleotidiche ed amminoacidiche. In seguito vengono illustrate le principali tecniche per la purificazione e l'analisi biochimica e funzionale di proteine e complessi macromolecolari, ottenuti a partire dalle fonti naturali o espresse in forma ricombinante.

-Stoppini, M e Bellotti, V “Biochimica Applicata” Ed. EdiSES
ISBN: 9788879597135
- Bonaccorsi di Patti, MC, et al. “Metodologie Biochimiche” Ed. CEA
ISBN: 9788808183293
-Amaldi, F et al. "Tecniche e metodi per la biologia molecolare"
ISBN: 9788808920348
- Review ed articoli scientifici suggeriti di volta in volta dal docente.
Il materiale non coperto da diritti d'autore, utilizzato a supporto delle lezioni frontali in aula, verrà messo a disposizione delle studentesse e degli studenti sulla piattaforma "DIR", al termine delle lezioni relative ad ogni macro-sezione (i.e. manipolazione, analisi e purificazione di acidi nucleici; analisi e purificazione di proteine; studio delle interazioni fra macromolecole). Tale materiale rappresenterà una guida per lo studio degli stessi argomenti sui testi in adozione e uno spunto per ulteriori approfondimenti individuali.

Il corso di "Biochimica applicata" descrive gli aspetti teorici e pratici e l'impatto dello studio delle macromolecole biologiche in diversi ambiti, dalle scienze mediche e biologiche, alle discipline bioanalitiche. Il corso mira a fornire alle studentesse e agli studenti una solida base per le loro future attività di studio e ricerca, incentrate sulla descrizione della struttura e della funzione delle proteine e sull'applicazione delle informazioni ottenute. A tal fine, verranno illustrati metodi classici e avanzati per la produzione, la purificazione, la manipolazione e la caratterizzazione biochimica delle macromolecole. "Progetti di ricerca" virtuali saranno assegnati ai team di studentesse e studenti, creati all'inizio del corso, con l'obiettivo di stimolare l'attitudine a un pensiero indipendente e critico e a lavorare in gruppo.

Si richiede una conoscenza generale: 1) della biochimica delle proteine e degli acidi nucleici
e 2) dei processi di replicazione del DNA, della trascrizione e della sintesi proteica.

Lezioni frontali.
Preparazione, a gruppi, di un progetto virtuale; 2-3 lezioni saranno dedicate alla presentazione dei progetti virtuali e alla loro discussione peer-to-peer.
Durante le lezioni verrà utilizzato materiale audio/video in inglese.
Verranno periodicamente programmate esercitazioni sull'utilizzo di banche dati e sullo svolgimento degli esercizi che fanno parte della prova d'esame.

Le studentesse e gli studenti con disabilità o con Disturbi Specifici dell’Apprendimento (DSA) o con Bisogni Educativi Speciali (BES) possono richiedere servizi e strumenti specifici a loro dedicati rivolgendosi allo Staff Sviluppo e Coordinamento Carriere e Servizi alle Studentesse e agli Studenti e consultando la pagina dedicata del sito di Ateneo: https://uniupo.it/it/servizi/servizi-studenti-disabili-e-dsa
Le studentesse e gli studenti con disabilità, DSA, BES, una volta preso contatto con lo Staff di Ateneo, possono contattare la/il docente titolare dell'insegnamento in relazione alla declinazione delle modalità di esame, in merito agli aspetti didattici.

Esame scritto.
Nel primo esercizio si verificherà la conoscenza dei passaggi necessari per creare una molecola di DNA ricombinante e per l'analisi della stessa (max. 8 pt), mentre il secondo esercizio consisterà nel definire una strategia per la sovra-espressione e/o la purificazione e la caratterizzazione biochimica di una proteina ricombinante (max. 10 pt); in entrambi i casi studentesse e studenti dovranno scegliere correttamente i metodi/le procedure/i materiali, delineando in maniera concisa ma completa la procedura. La domanda a risposta aperta potrà vertere su un argomento tecnico (e.g. principi ed applicazioni della cromatografia per affinità) o su un argomento di più ampio respiro (e.g. metodi biofisici d'indagine di interazioni fra macromolecole) e servirà a verificare non solo la conoscenza dettagliata dell'argomento ma anche un'attività di studio individuale di approfondimento (max. 12 pt). Il test dovrà essere svolto in ogni sua parte, ottenendo almeno i seguenti punteggi: 1° esercizio 5/8; 2° esercizio: 5/10; domanda aperta: 8/12. La presentazione a gruppi del progetto virtuale darà diritto ad un max. di 3 punti supplementari.

Richiami sulle caratteristiche e sui processi di sintesi e modificazione delle macromolecole biologiche, sfruttabili per la loro purificazione/analisi. La tecnologia del DNA ricombinante applicata all'espressione di proteine ricombinanti. La reazione a catena della polimerasi (PCR): principi, strumentazione, disegno dei primers e impostazione della procedura. Elettroforesi su gel d'agarosio per l'analisi di campioni di DNA: principi, strumentazione ed esempi. I vettori plasmidici di sottoclonaggio: caratteristiche generali. I vettori plasmidici per l'espressione di proteine ricombinanti in batteri. Altri vettori per la creazione di molecole di DNA ricombinante. La trasformazione di batteri competenti. Purificazione di DNA plasmidico da colture batteriche monoclonali. La purificazione di DNA genomico. La produzione di genoteche di cDNA. Le endonucleasi di restrizione: caratteristiche generali ed utilizzo nella tecnologia del DNA ricombinante. La reazione di ligazione. Estrazione di frammenti di DNA da matrici d'agarosio. La mutagenesi sito-specifica basata sull'utilizzo della PCR: principi, esempi ed applicazioni. Il sequenziamento del DNA: il metodo classico di Sanger e sua automazione. Analisi di acidi nucleici mediante tecniche di ibridazione: principi ed applicazioni. Tecniche di marcatura di sonde di DNA.
L'espressione di proteine ricombinanti in sistemi eterologhi: l'espressione inducibile di proteine in E. coli. Il sistema d'espressione Baculovirus/cellule d'insetto. Trascrizione e traduzione accoppiate in vitro. Cellule di lievito come sistema d'espressione di proteine ricombinanti.
Lavorare con le proteine: regole generali. Metodi di distruzione cellulare (lisi): shock osmotico, stress meccanico, utilizzo di apparati basati su shock di pressione/impatto, ultra-sonicazione, utilizzo di detergenti per la solubilizzazione di campioni biologici; principi, limiti ed applicabilità dei metodi. Centrifugazione di campioni biologici: principi e strumentazione. Frazionamento cellulare mediante centrifugazione differenziale. Metodi di quantificazione delle proteine presenti in un campione. Elettroforesi di proteine: principi e strumentazione. La separazione elettroforetica di proteine mediante SDS-PAGE. L'analisi di proteine mediante IEF (isoelettrofocalizzazione): principi, applicazioni e strumentazione. Elettroforesi 2D: principi e strumentazione. L'elettroforesi in condizioni native e altre tecniche elettroforetiche. Metodi di colorazione "totali" o "gruppo-specifici" di proteine separate mediante elettroforesi. Metodi di immuno-riconoscimento su membrana: il western blot e dot-blot. Saggi immunologici: principi generali. Test ELISA, RIA e saggio immunologico competitivo, con esempi. L'immuno-cromatografia a flusso laterale applicata a dispositivi usa-e-getta. Introduzione alle tecniche di cromatografia liquida (LC) utilizzate nella purificazione di macromolecole biologiche. La cromatografia per affinità: matrici funzionalizzate con ligandi gruppo-specifici e mono-specifici. Approcci cromatografici per l'isolamento di proteine ricombinanti dotate di "etichette"(tag) di purificazione per affinità. La cromatografia a scambio ionico (IEC). La cromatografia per interazione idrofobica (HIC). La cromatografia ad esclusione dimensionale (Size Exclusion Chromatography, SEC); altre applicazioni della SEC: studio di interazioni proteina-proteina e dello stato oligomerico di proteine. Metodi per la concentrazione di proteine in un campione. Considerazioni sulle strategie da adottare per l'allestimento di saggi per la caratterizzazione di enzimi e per il monitoraggio dei passaggi durante una procedura di purificazione di proteine.
Lo studio delle interazioni fra macromolecole: un'introduzione. Pull-down e co-immunopurificazione. Il sistema doppio-ibrido di lievito "classico" (2HYS) per la conferma d'interazioni e come approccio di "interaction cloning". Il fenomeno della "risonanza dei plasmoni di superficie" (surface plasmon resonance, SPR) applicata allo studio quantitativo e in tempo reale di interazioni fra macromolecole o proteina/ligando a piccola molecola: principi e strumentazione. L'analisi del fenomeno della FRET nello studio in vitro e in vivo di interazioni fra proteine: principi ed applicazioni.

Alla fine del corso, studentesse e studenti avranno acquisito conoscenza e comprensione degli argomenti trattati e sviluppato la capacità di applicare tali conoscenze in modo autonomo nell'affrontare e risolvere questioni nuove e/o problemi più complessi. Più nel dettaglio, conosceranno e saranno in grado di comprendere: a) metodi, tecniche e protocolli sperimentali per la produzione e la purificazione di proteine ed acidi nucleici destinati all'impiego in campo biotecnologico e diagnostico e b) metodi, tecniche e protocolli sperimentali per la manipolazione e la caratterizzazione biochimica e funzionale di proteine, acidi nucleici e loro complessi. Saranno in grado di applicare tali conoscenze e capacità di comprensione per: a) imbastire un protocollo sperimentale per l'espressione e/o la purificazione di proteine, acidi nucleici e loro complessi; b) adattare a casi specifici procedure già presenti in letteratura per l'analisi biochimica e funzionale di macromolecole biologiche; c) sviluppare nuove procedure di analisi biochimica e funzionale di macromolecole biologiche, scegliendo correttamente le condizioni sperimentali e la strumentazione/metodologia adeguate per la conduzione degli esperimenti; d) redigere report su attività sperimentali. Nella progettazione della propria attività di ulteriore approfondimento ed espansione delle conoscenze acquisite, studentesse e studenti sapranno attingere alle fonti corrette e selezionare criticamente il materiale di studio, includendo testi scientifici anche redatti in lingua inglese. Sapranno infine comunicare correttamente la materia, usando la terminologia appropriata. Queste capacità potranno, inoltre, rivelarsi utili nell'attività di ricerca sperimentale e nella stesura del manoscritto di tesi, qualora lo Studente decida di svolgere l'internato di tesi in un laboratorio di area "BIO".