Ateneo - UPO

Significato della misura in ambito biologico.
Tecniche di preparazione del campione.
Principi di spettrofotometria.
Principi alla base della cromatografia.
Principi alla base dell'elettroforesi.
Tecniche per la caratterizzazione di proteine.
Applicazioni degli anticorpi nelle biotecnologie.
Utilizzo di enzimi in diagnostica ed in ricerca.
Saggi di binding ed associazione.

Suggeriti soprattutto a chi non abbia un robusto background chimico:
- Metodologie biochimiche Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine, Seconda edizione, Zanichelli. A cura di Maria Carmela Bonaccorsi Di Patti, Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo
- Metodologie biochimiche e biomolecolari, Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio, Zanichelli Mauro Maccarrone
- PRINCIPI DI METODOLOGIA BIOCHIMICA di C. De Marco, C. Cini – Ed. Piccin

Le esercitazioni mirano a far acquisire le capacità pratiche richieste per l’utilizzo delle tecniche biochimiche di base e per un proficuo internato di tesi.
Le lezioni di teoria del laboratorio presentano tecniche avanzate che lo studente incontra nella letteratura scientifica.

Lo studente DEVE aver frequentato con successo il corso "sucurezza nei laboratori chimici e biologici".
Sono propedeutiche le conoscenze sulla struttura e proprietà delle molecole fornite dalla chimica inorganica e chimica organica.

Il corso comprende:
- lezioni frontali sulle principali tecniche
- simulazioni informatiche delle principali tecniche ed esercitazioni di bioinformatica
- esercitazioni in laboratori didattici chimico-biologici.
La frequenza è obbligatoria.

Al termine delle esercitazioni lo studente presenterà un quaderno di laboratorio che insieme al rendimento in laboratorio costituirà la base per la successiva valutazione. Si ricorda che la frequenza dei laboratori didattici è obbligatoria.

Saranno dichiarati "idonei" tutti gli studenti che avranno frequentato le lezioni teoriche ed il laboratorio (70% minimo) nonché svolto le esercitazioni su DIR.
Durante l'esame del corso integrato saranno verificate le conoscenze relative anche a questo modulo.

Significato della misura in ambito biologico: specificità, accuratezza, precisione e riproducibilità.

Tecniche di preparazione del campione per analisi biochimiche (omogenizzazione, lisi con detergenti). Estrazione con solventi e precipitazione selettiva, loro applicazione al frazionamento dei composti biologici (estrazione di lipidi, salting out di proteine ed acidi nucleici). Teoria della centrifugazione e tecniche di centrifugazione preparativa per il frazionamento di composti biologici. Utilizzo delle centrifughe e forza centrifuga.

Principi di spettrofotometria. Saranno trattate le basi teoriche e gli aspetti pratici delle tecniche spettroscopiche (assorbimento, fluorescenza, polarimetria) ed esempi del loro utilizzo per la quantificazione di analiti biologici. Caratteristiche di uno spettrofotometo ed un fluorimetro, loro utilizzo.

Radioisotopi in laboratorio: caratteristiche dei radioisotopi di uso più comune, loro utilizzi in biochimica e strumentazione utilizzata per la loro quantificazione.

Principi alla base della cromatografia, principali tecniche cromatogafiche (affinià, gel filtrazione, scambio ionico e fase inversa) e relative matrici. Utilizzo della cromatografia per la separazione di miscele complesse di proteine e di lipidi in base alle proprietà chimiche e fisiche. Strumentazione utilizzata (cromatografie su colonna, su strato sottile, HPLC, ecc). Rivelatori ed analisi risultati (coefficienti di ritenzione, analisi qualitative e quantitative).

Principi alla base dell'elettroforesi con particolare attenzione al frazionamento e caratterizzazione delle proteine. IEF, SDS-PAGE, 2D-PAGE, elettroforesi capillare. Sistemi di rilevazione più comuni: coloranti e western blotting.

Caratterizzazione di proteine: digestione, sequenziamento di Edman, utilizzo della spettrometria di massa per la caratterizzazione delle proteine, proteomica qualitativa e quantitativa con particolare attenzione alle tecniche di spettrometria di massa.

Applicazioni degli anticorpi nelle biotecnologie, saggi immunologici competitivi e non competitivi, RIA, ELISA, immunofluorescenza, western blotting, immunodiffusione e tecniche correlate.

Utilizzo di enzimi in diagnostica ed in ricerca. Caratterizzazione della cinetica enzimatica e studio degli inibitori. Utilizzo di enzimi in diagnostica clinica, assay cinetici ed end-point applicati alla ricerca ed alla diagnostica. Analisi di parametri cinetici di un enzima.

Saggi di binding ed associazione, analisi dell’equilibrio recettore-ligando. Metodiche per lo studio delle interazioni molecolari, saggi classici con molecole marcate, metodiche spettrometriche avanzate: Fret, Bret, fluorescenza a tempo risolto.

Lo studente acquisirà la conoscenza delle principali metodologie biochimiche con particolare enfasi allo studio delle proteine. Tali saperi sono utili per la lettura critica della letteratura tecnica.
Le esercitazione consentono di muoversi fruttuosamente in laboratorio anche in vista del tirocinio di laurea. A tale scopo la pratica nella compilazione del quaderno di laboratorio risulta importante.