Ateneo - UPO

1_I biomarcatori nella medicina di laboratorio. Le diverse classi di biomarcatori e significato biologico. Ambito di utilizzo e significato clinico dei biomarcatori. Cenni sul significato di medicina di precisione e personalizzata. Come la fase preanalitica, analitica e port-analitica influiscono sul significato del risultato di laboratorio. Il. significato del valore informativo di un test nei vari contesti diagnostici 2_Biomarcatori genetici. The Human Genome Project (HGP). Applicazioni cliniche delle indagini molecolari. Tecniche di analisi degli acidi nucleici 3_Principali tecniche di indagine biochimiche 4_Biomarcatori proteici e enzimatici. Proteine plasmatiche e proteoma. Analisi proteomica. Criteri di scelta e metodi di determinazione dei biomarcatori enzimatici nel laboratorio clinico. 5_Biomarcatori metabolici. Applicazioni cliniche dell’analisi metabolomica: le alterazioni congenite del metabolismo.

Antonozzi-Gulletta Medicina di Laboratorio Logica e Patologia Clinica, III Edizione, Piccin Materiale fornito dal docente

Comprendere come i markers metabolici, proteici e genetici possano essere utilizzati in ambito diagnostico, predittivo e terapeutico. Acquisire consapevolezza sui limiti e le potenzialità cliniche delle nuove tecnologie omiche. Capire come le tecniche biochimiche e di biologia molecolare vengano utilizzate in ambito diagnostico e saper valutare come la scelta di un metodo d’analisi e la modalità in cui esso sarà utilizzato influiranno sulla qualità del risultato e sul valore informativo che esso apporterà alla pratica clinica. Conoscere l’ambito di utilizzo dei biomarcatori enzimatici di interesse diagnostico e dei marcatori metabolici nella valutazione della funzionalità d’organo e nella diagnosi dei disordini metabolici.

Conoscenze di base di biologia cellulare, biochimica e biologia molecolare

Lezioni frontali mediante la proiezione di diapositive. Discussione in aula di casi per presentare precise problematiche di diagnostica molecolare e guidare lo studente alla loro risoluzione. Per la preparazione dell'esame gli studenti potranno utilizzare il materiale fornito dal docente (copia pdf delle diapositive proiettate a lezione, di dispense preparate dal docente e di alcuni articoli tratti da riviste scientifiche che approfondiscono gli argomenti trattati durante il corso) e sui libri di testo consigliati

Copia pdf delle diapositive proiettate, il materiale di approfondimento e tutte le informazioni riguardanti il corso e le modalità di esame saranno rese disponibili sulla piattaforma moodle DIR (https://www.dir.uniupo.it/ )

L’obiettivo della prova d’esame consiste nel verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente. L'esame prevede il superamento di una prova scritta che consiste in una serie di domande relative a tutti gli argomenti del programma del corso che possono consistere in: i) quiz con risposta a scelta multipla o vero/falso e ii) domande aperte che prevedono la risoluzione di problemi inerenti la valutazione delle proprietà di un test di laboratorio (sensibilità, specificità e valore predittivo) o la breve esposizione di tematiche affrontate durante il corso. L’esame consentirà di valutare le conoscenze teoriche, il senso critico, la capacità di comprensione del testo (esercizi con richiesta operare una scelta tra diverse alternative) e la capacità di applicare le conoscenze apprese a situazioni pratiche. La valutazione sarà espressa in trentesimi (voto minimo 18). Il programma e le modalità di esame saranno reperibili sulla piattaforma moodle DIR

1_I biomarcatori nella medicina di laboratorio - Le diverse classi di biomarcatori e significato biologico: proteine e proteoma, metaboliti e metaboloma, genetica e genoma. - Ambito di utilizzo e significato clinico dei biomarcatori: biomarcatori diagnostici, predittivi, prognostici, di efficacia, di evoluzione. - Cenni sul significato di medicina di precisione e personalizzata. Definizione di big data, machine learning, intelligenza artificiale e data science. -Interpretazione e significato del risultato di laboratorio. Come la fase preanalitica, analitica e port-analitica influiscono sul significato del risultato di laboratorio. Variabilità vera e variabilità indotta. Gli anticoagulanti: modalità di azione. I parametri che caratterizzano un metodo analitico: esattezza, accuratezza, precisione, specificità e sensibilità analitiche; robustezza, campo di misura, risoluzione, limite di rilevabilità e limite di quantificazione. Sensibilità e specificità diagnostica. Valore predittivo di un test diagnostico. Il significato del valore informativo di un test nei vari contesti diagnostici 2_Biomarcatori genetici Introduzione -The Human Genome Project (HGP). La storia del HGP, caratteristiche del genoma consenso GRCh38. I limiti del CRCh38. Assemblamento di un genotipo diploide. Il Telomere-to-Telomere Consortium, il progetto ENCODE, il progetto Human Pangenome. - RNA non codificanti: classificazione generale e potenziale ruolo clinico -Classificazione e conseguenze funzionali delle alterazioni genetiche indagate in diagnostica molecolare. Applicazioni cliniche delle indagini molecolari. -Potenzialità e limiti dei test molecolari. La scelta del materiale biologico di partenza, in funzione del tipo di indagine e la finalità del test molecolare che si vuole effettuare. Tecniche di analisi degli acidi nucleici -L’estrazione degli acidi nucleici da cellule nucleate di sangue periferico e midollare e da tessuti freschi o fissati. Metodi di purificazione e la quantificazione degli acidi nucleici. -PCR qualitativa e quantitativa real-time: principi ed esempi di applicazione per la determinazione di piccole delezioni, amplificazioni, duplicazioni, traslocazioni. Esempi di applicazione della PCR qualitativa e quantitativa per la diagnosi e il monitoraggio della malattia minima residua in ambito oncologico. -Sequenziamento degli acidi nucleici. Dal sequenziamento mediante tecnica Sanger al “single molecule sequencing”. -Analisi di alterazioni strutturali del genoma: array Comparative Genomic Hybridization (CGH) e cariotipo molecolare. Fluorescent in situ Hybridization (FISH). 3_Principali tecniche di indagine biochimiche -Analisi spettrometriche: caratteristiche generali. Spettrofotometria: cromofori e reazioni cromogene. Legge di Lambert-Beer. Reazioni cinetiche e end-point per l’analisi di metaboliti e enzimi plasmatici. -La fluorescenza. La microscopia a fluorescenza per lo studio dei componenti cellulari. Analisi al citofluorimetro dell’apoptosi e del ciclo cellulare. -Tecniche elettroforetiche e immunometriche per lo studio delle proteine. Elettroforesi non denaturante e elettroforesi denaturante (SDS-PAGE/western blot). Immunoprecipitazione-western blot. Tecniche ELISA -Cromatografia e cenni di spettrometria di massa 4_Biomarcatori proteici e enzimatici Biomarcatori proteici nella medicina di laboratorio -Le proteine del plasma: classificazione funzionale, cause che ne determinano variazioni quantitative. Alcuni esempi relativi alla determinazione di proteine plasmatiche. -L’analisi proteomica con spettrometria di massa. Approccio “Bottom-Up” e “Top-down”. Analisi del proteoma del plasma. Il progetto “PeptideAtlas” Altre tipologie di analisi del proteoma: tecnologia Somascan e Proximity Extension Assays (PEA). Biomarcatori enzimatici - Criteri di scelta per i biomarcatori enzimatici nel laboratorio clinico. Metodi di determinazione delle attività enzimatiche. Fattori generali che condizionano i livelli dei diversi enzimi nel sangue in condizione di salute e di malattia. Fattori che influenzano l’utilità diagnostica di un enzima - Principali enzimi utilizzati nel laboratorio clinico: basi biochimiche della funzione in condizioni di normalità e razionale biologico per il loro utilizzo come marcatori di malattia. Definizione e valore diagnostico degli isoenzimi. Alcuni esempi relativi al significato clinico della misurazione di alcuni enzimi plasmatici: transaminasi, creatina chinasi, lattico deidrogenasi. 5_Biomarcatori metabolici: applicazioni cliniche dell’analisi metabolomica Cenni di analisi metabolomica -Definizione di metabolita, metaboloma e analisi metabolomica. Definizione di analisi metabolomica “Targeted” e “Untargeted”. Limiti dell’analisi metabolomica “Untargeted”. Tecniche d’indagine metabolomica: gascromatografia e HPL accoppiate a spettrometria di massa. Applicazione della metabolomica nella diagnosi delle alterazioni congenite del metabolismo -Classificazione “biochimica” dei markers di laboratorio utilizzati nella diagnosi delle alterazioni congenite del metabolismo. Ambiti di applicazione e limiti delle indagini del proteoma e dei dosaggi enzimatici -Indagini del metaboloma: significato diagnostico del profilo degli acidi grassi liberi, degli acidi organici e degli aminoacidi. Esempi di alterazioni congenite del metabolismo: fenilchetonuria, Medium-Chain Acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency.

Essere in grado di valutare in maniera autonoma quanto le condizioni pre-analitiche e analitiche contribuiscano a determinare la qualità ed il valore informativo di un risultato di laboratorio. Saper valutare l’adeguatezza di un test di laboratorio in funzione dei principi chimico-fisici sui quali il test si fonda e delle caratteristiche del marker indagato. Conoscere i criteri in base ai quali determinanti biomarcatori genetici, proteici o metabolici vengono ritenuti più adatti nella diagnostica di laboratorio. Acquisire consapevolezza riguardo le potenzialità cliniche, ma anche le criticità, associate alle analisi untargeted di tipo omico