Ateneo - UPO

Il corso tratta i metodi molecolari applicati allo studio degli ecosistemi: marcatori molecolari e diversità genetica delle popolazioni; identificazione delle specie mediante DNA barcoding; metabarcoding e DNA ambientale per il biomonitoraggio; metagenomica e metatrascrittomica; trascrittomica differenziale e biomarcatori molecolari di stress; elementi di proteomica, metabolomica ed epigenetica ecologica; interpretazione e uso dei dati molecolari in ambito ambientale e normativo. Il corso comprende 32 ore di lezione frontale e 16 ore di laboratorio sperimentale a protocollo guidato, che percorre la filiera completa dal campionamento in campo al dato interpretato.

Dispense del docente (moduli 1-12), disponibili sulla piattaforma del corso prima dell'inizio delle lezioni. Costituiscono il riferimento principale e sono autosufficienti per la preparazione dell'esame.

Testi di approfondimento

Freeland J.R., Molecular Ecology, 3ª ed., Wiley-Blackwell, 2020.
van Straalen N.M., Roelofs D., An Introduction to Ecological Genomics, 2ª ed., Oxford University Press, 2012.
Taberlet P., Bonin A., Zinger L., Coissac E., Environmental DNA: For Biodiversity Research and Monitoring, Oxford University Press, 2018.
Materiale integrativo Protocolli di laboratorio, schede dati, dataset del workshop bioinformatico, set di autoverifica per modulo e articoli primari per la discussione, tutti forniti dal docente sulla piattaforma del corso.

Il corso fornisce gli strumenti concettuali e sperimentali con cui i metodi molecolari rispondono a domande ecologiche: identificare gli organismi presenti in un ambiente, misurare la diversità genetica di una popolazione, descrivere la composizione di una comunità a partire dal DNA ambientale, rilevare la risposta di un organismo a uno stress prima che sia visibile a livello di individuo o di popolazione. Accanto alla trattazione teorica, il corso comprende un laboratorio sperimentale a protocollo guidato che percorre per intero una filiera analitica reale, dal campione di suolo al dato interpretato.

Obiettivi per lo sviluppo sostenibile (Agenda 2030)
SDG 15 — Life on Land. Metodi molecolari per la misura della biodiversità terrestre e della qualità biologica del suolo.
SDG 6 — Clean Water and Sanitation. DNA ambientale e metabarcoding applicati al monitoraggio della qualità delle acque.
SDG 4 — Quality Education. Materiale didattico completo e accessibile in anticipo, progettato per garantire un percorso di studio equivalente agli studenti che non possono frequentare con regolarità.

Sono richieste le conoscenze di base di biologia molecolare (struttura e replicazione degli acidi nucleici, trascrizione, PCR), di genetica (trasmissione dei caratteri, polimorfismo, frequenze alleliche) e di ecologia (popolazione, comunità, ecosistema, indici di diversità) acquisite nel corso di laurea triennale. Non sono richieste competenze informatiche pregresse: gli strumenti bioinformatici utilizzati nel laboratorio sono introdotti dal docente e impiegati con procedura guidata.

Lezioni frontali con dispense complete rese disponibili sulla piattaforma del corso prima dell'inizio delle lezioni. Per ciascun modulo è fornito un set di domande di autoverifica con soluzioni commentate. Laboratorio sperimentale svolto su protocolli forniti, con schede dati predisposte. Workshop di analisi bioinformatica su dataset fornito. Discussione guidata di un articolo primario per ciascun macro-argomento.

Il materiale del corso è progettato per essere autosufficiente: lo studente che non può frequentare con regolarità dispone di un percorso di studio completo — dispense, set di autoverifica e kit dati del laboratorio — e sostiene il medesimo esame, senza riduzioni né integrazioni di programma.

Studenti non frequentanti
La frequenza non è obbligatoria. Programma, prova d'esame e criteri di valutazione sono identici per gli studenti frequentanti e non frequentanti; non esiste un programma ridotto né una prova alternativa.

Per consentire a chi non può frequentare il laboratorio di redigere la relazione richiesta, è pubblicato sulla piattaforma del corso, contestualmente alle dispense e all'apertura delle lezioni, un kit dati del laboratorio contenente: fotodocumentazione e videoregistrazione breve delle operazioni sperimentali; i protocolli distribuiti in aula; le schede degli endpoint ecotossicologici compilate nel corso della campagna, complete di replicati e controlli; le rese di estrazione, le immagini dei gel e gli elettroferogrammi Sanger grezzi; la tabella ASV del dataset di metabarcoding con i metadati dei campioni; le schede dati in bianco.

Lo studente non frequentante redige la relazione di laboratorio sul medesimo template e viene valutato con la medesima griglia dei frequentanti. La prova orale valuta, per la parte di laboratorio, la logica dei protocolli, la scelta dei controlli e l'interpretazione dei risultati; non è oggetto di valutazione l'esecuzione manuale delle procedure.

Altro
Il ricevimento si svolge su appuntamento concordato per posta elettronica. Tutto il materiale del corso è pubblicato sulla piattaforma didattica prima dell'inizio delle lezioni.

Gli studenti con disabilità o con disturbi specifici dell'apprendimento sono invitati a contattare il docente e il servizio di Ateneo dedicato per concordare le misure compensative e dispensative previste, sia per la didattica sia per le prove d'esame: https://www.uniupo.it/it/servizi/servizi-studenti-disabili-e-dsa

La frequenza del laboratorio è subordinata alla formazione sulla sicurezza prevista dall'Ateneo e all'uso dei dispositivi di protezione individuale forniti.

La prima sessione di laboratorio prevede un'uscita di campionamento presso un'azienda agricola del territorio; modalità di trasporto, copertura assicurativa e calendario sono comunicati all'inizio del corso.

La valutazione si articola in tre elementi, comunicati nella prima lezione e pubblicati con il materiale del corso.

1. Relazione di laboratorio. Redatta sul template fornito (massimo 6 pagine: Introduzione, Materiali e metodi, Risultati, Discussione, Bibliografia), da consegnare entro 15 giorni dalla conclusione del laboratorio. È valutata idoneo / non idoneo secondo la griglia pubblicata. L'idoneità è requisito di accesso all'esame e non contribuisce al voto. In caso di non idoneità è ammessa una revisione entro 10 giorni. Gli studenti che non hanno frequentato il laboratorio redigono la relazione utilizzando il kit dati pubblicato sulla piattaforma del corso, sul medesimo template e con la medesima griglia di valutazione.

2. Quiz finale. Trenta domande a risposta multipla (quattro opzioni, una sola corretta), 45 minuti, nessuna penalità per le risposte errate. Il punteggio minimo di 18/30 dà accesso alla prova orale e non contribuisce al voto.

3. Prova orale. Tre domande, una per ciascuno dei tre macro-argomenti del corso (identificazione molecolare e diversità; omiche ambientali e risposte allo stress; interpretazione e uso del dato). La prova orale determina integralmente il voto finale, secondo la griglia pubblicata con il materiale del corso.

Griglia della prova orale. 18-20: conosce gli elementi fondamentali dei tre macro-argomenti e la logica dei metodi, con terminologia accettabile. 21-23: esposizione corretta e ordinata; sa indicare a cosa serve ciascuna tecnica e quale dato produce. 24-26: collega i contenuti tra moduli, riconosce i limiti di una tecnica, interpreta un risultato semplice. 27-29: argomenta scelte metodologiche alternative e discute criticamente un caso studio. 30 e 30 con lode: padronanza completa, autonomia interpretativa, collegamento con la letteratura primaria.

Griglia della relazione. È idonea la relazione che presenta tutte le sezioni previste, riporta i dati con unità di misura e numero di replicati, contiene almeno una figura corretta e leggibile, affronta le tre domande guida della Discussione e ha bibliografia conforme.

Lezioni frontali (32 ore, 16 lezioni da 2 ore)
1. Che cos'è l'ecologia molecolare (2 h). Livelli di organizzazione biologica dal gene alla comunità. Quali domande ecologiche ammettono una risposta molecolare e quali no. Tipologie di marcatori e loro risoluzione temporale e tassonomica.

2. Il campione prima del dato (2 h). Disegno di campionamento, replicazione e potenza. Conservazione delle matrici ambientali e degradazione degli acidi nucleici. Catena di custodia e tracciabilità. Che cosa determina la qualità di un dato molecolare.

3. Diversità genetica e struttura di popolazione — I (2 h). Polimorfismo ed eterozigosi. Equilibrio di Hardy-Weinberg e sue violazioni. Deriva genetica, dimensione effettiva della popolazione, collo di bottiglia.

4. Diversità genetica e struttura di popolazione — II (2 h). Flusso genico e F-statistics: calcolo e interpretazione. Connettività delle popolazioni e genetica della conservazione. Determinazione sessuale attraverso l'albero della vita: determinazione cromosomica e ambientale (ESD/TSD), marcatori sesso-specifici, sex-ratio come endpoint ecologico e sua alterazione da contaminanti.

5. Identificazione molecolare delle specie (2 h). Logica del DNA barcoding. Scelta del marcatore: COI negli animali, rbcL e matK nelle piante, ITS nei funghi, 16S e 18S rRNA. Database di riferimento: BOLD, GenBank, SILVA, UNITE. Sequenziamento Sanger e interpretazione dell'elettroferogramma.

6. Limiti dell'identificazione molecolare (2 h). Barcode gap e sua assenza. Pseudogeni nucleari di origine mitocondriale (NUMT). Introgressione, ibridazione, eredità mitocondriale e discordanza con la filogenesi nucleare. Specie criptiche. Completezza e qualità dei database di riferimento come fattore limitante.

7. Metabarcoding e DNA ambientale (2 h). DNA ambientale: origine, stato, persistenza e trasporto nelle diverse matrici. Disegno dei primer e bias di amplificazione. Preparazione delle librerie e piattaforme di sequenziamento. Applicazioni: biomonitoraggio delle acque, rilevamento precoce di specie aliene, analisi della dieta, comunità del suolo.

8. Dall'amplicone alla tabella di comunità (2 h). Filtraggio di qualità, denoising, OTU e ASV. Assegnazione tassonomica e sue incertezze. Controlli negativi e positivi, contaminazione, index hopping. Abbondanza relativa: che cosa si può e che cosa non si può inferire sull'abbondanza reale.

9. Metagenomica (2 h). Shotgun sequencing e confronto con l'approccio ad ampliconi. Controllo di qualità delle letture e rimozione delle sequenze dell'ospite. Assemblaggio, binning e genomi assemblati da metagenoma (MAG): che cosa consentono di affermare e con quale incertezza.

10. Metatrascrittomica e funzione (2 h). Annotazione funzionale e banche dati di riferimento. Distinzione tra profilo tassonomico, potenziale funzionale e funzione effettivamente espressa. Il microbioma del suolo come indicatore di qualità: geni e funzioni impiegati come descrittori.

11. Espressione genica e trascrittomica differenziale (2 h). Regolazione dell'espressione genica in risposta a fattori di stress. Disegno di un esperimento di trascrittomica differenziale: replicazione, confondenti, normalizzazione. Significato e limiti di un log2 fold change; molteplicità dei test e controllo dell'FDR. Analisi di arricchimento funzionale e sue insidie interpretative.

12. Biomarcatori e ecotossicologia molecolare (2 h). Biomarcatori molecolari: criteri di validità, specificità, relazione con la dose e con l'effetto. Adverse Outcome Pathway: struttura e uso. Elementi di ecotossicologia molecolare; collegamento tra risposta molecolare ed endpoint di popolazione.

13. Proteomica e metabolomica ambientale (2 h). Approcci analitici e loro risoluzione. Informazione aggiuntiva rispetto al trascrittoma e costo relativo. Problemi specifici delle matrici ambientali e degli organismi non modello.

14. Epigenetica ecologica e integrazione multi-omica (2 h). Metilazione del DNA e altre marche epigenetiche. Plasticità fenotipica ed effetti transgenerazionali: evidenze e cautele interpretative. Integrazione multi-omica: strategie, requisiti di disegno e limiti reali.

15. Interpretazione dei dati di comunità (2 h). Diversità alfa e beta. Rarefazione e normalizzazione della profondità di sequenziamento. Ordinamenti (PCoA, NMDS) e loro lettura. Test di ipotesi su dati di comunità e scelta della distanza.

16. Dal dato alla decisione (2 h). Approccio weight of evidence. Impiego dei dati molecolari nel contesto normativo ambientale. Discussione di casi studio e riepilogo della filiera analitica percorsa nel laboratorio.

Laboratorio (16 ore, 4 sessioni da 4 ore)
Il laboratorio segue un filo conduttore unico: la caratterizzazione di un suolo proveniente da un ambiente produttivo (azienda vinicola), integrando un saggio ecotossicologico normato e l'identificazione molecolare degli organismi presenti. Tutte le attività sono svolte su protocollo fornito, con schede dati predisposte da compilare.

L1 — Campionamento in campo (4 h). Uscita presso l'azienda agricola. Definizione del piano di campionamento sul posto: punti, replicati, profondità, controlli. Prelievo dei campioni di suolo, georeferenziazione, etichettatura e compilazione della catena di custodia. Caratterizzazione di base dei campioni (umidità, pH). Prodotti: piano di campionamento e scheda campione compilati.

L2 — Allestimento del saggio ed estrazione (4 h). Preparazione degli elutriati. Allestimento del saggio su anellidi oligocheti (test di evitamento ISO 17512-1 oppure OECD 207). Estrazione di acidi nucleici da suolo e da tessuto, quantificazione e controllo di qualità. Prodotti: scheda di allestimento, scheda estrazione (resa, rapporto A260/280).

L3 — Lettura degli endpoint e amplificazione (4 h). Sessione calendarizzata ad almeno 14 giorni da L2, come richiesto dalla durata del saggio. Lettura degli endpoint ecotossicologici (evitamento, mortalità, biomassa) e calcolo. PCR di barcoding ed elettroforesi su gel. Preparazione dei campioni per il sequenziamento. Prodotti: scheda endpoint con calcolo, immagine del gel annotata.

L4 — Workshop bioinformatico (4 h). Editing degli elettroferogrammi Sanger; interrogazione di BLAST e BOLD; allineamento e albero di identificazione. Analisi di un dataset di metabarcoding fornito: tabella ASV, diversità alfa e beta, ordinamento, produzione delle figure. Interpretazione integrata dei dati molecolari ed ecotossicologici. Prodotti: tabella di assegnazione tassonomica con criteri espliciti, due figure, paragrafo di interpretazione.

Il corso fornisce gli strumenti concettuali e sperimentali con cui i metodi molecolari rispondono a domande ecologiche: identificare gli organismi presenti in un ambiente, misurare la diversità genetica di una popolazione, descrivere la composizione di una comunità a partire dal DNA ambientale, rilevare la risposta di un organismo a uno stress prima che sia visibile a livello di individuo o di popolazione. Accanto alla trattazione teorica, il corso comprende un laboratorio sperimentale a protocollo guidato che percorre per intero una filiera analitica reale, dal campione di suolo al dato interpretato.

Descrittori di Dublino
Conoscenza e comprensione. Alla fine del corso lo studente conosce i marcatori molecolari impiegati in ecologia e il loro dominio di applicazione; le basi teoriche e i limiti del DNA barcoding, del metabarcoding e dell'analisi del DNA ambientale; i principi della metagenomica e della metatrascrittomica; i meccanismi molecolari delle risposte allo stress e gli elementi di ecotossicologia molecolare.

Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente esegue, seguendo protocolli forniti, le principali operazioni di laboratorio dell'ecologia molecolare — estrazione di acidi nucleici da matrici ambientali e da tessuto, amplificazione di marcatori diagnostici, allestimento e lettura di un saggio ecotossicologico normato — e interpreta l'output di una pipeline bioinformatica standard applicata a un dataset fornito, producendo tabelle e figure corrette.

Autonomia di giudizio. Lo studente riconosce i limiti di validità di un dato molecolare — adeguatezza dei controlli, contaminazione, bias di amplificazione, completezza del database di riferimento — e distingue le conclusioni sostenute dai dati da quelle che li eccedono.

Abilità comunicative. Lo studente redige una relazione scientifica su struttura data, con tabelle e figure proprie e bibliografia conforme, e sostiene oralmente un'esposizione ordinata con terminologia appropriata.

Capacità di apprendimento. Lo studente sa reperire e leggere un articolo primario di ecologia molecolare in lingua inglese e collocarne i metodi tra quelli trattati nel corso.